РАЗРАБОТКА МИКРОЧИПОВОЙ АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ С ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫМИ ПЦР РЕАГЕНТАМИ В АЛЮМИНИЕВЫХ МИКРОЧИПАХ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ МЕТОДОМ ПЛАЗМЕННО-ХИМИЧЕСКОГО ОСАЖДЕНИЯ

А. О. Suvorova, P. N. Мashyanov, Y. V. Аshyna, М. N. Slyadnev, А. А. Ganeev

Аннотация


Микрочиповые аналитические системы для молекулярно-генетического анализа в последние годы привлекают повышенный интерес исследователей. Алюминиевые микрочипы являются особенно перспективными для внедрения микрочипового формата полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторную практику. Подобные микрочипы требуют пассивации поверхности для предотвращения ингибирования ПЦР и улучшения аналитических характеристик системы. Привлекательна и возможность снижения трудозатрат и ошибок оператора за счет лиофилизации реактивов в микрочипах. Микрочипы с лиофилизированными реактивами позволяют избежать сложностей, связанных с хранением при низкой температуре, сокращают количество стадий пипетирования и тем самым уменьшают риск ложноположительных результатов, которые могут быть вызваны контаминацией проб. В работе предложен метод иммобилизации реагентов для ПЦР в микрореакторах алюминиевых микрочипов, поверхность которых была предварительно пассивирована с помощью плазмохимического осаждения из газовой фазы (ПХО). В качестве модельных объектов для лиофилизации выбраны тест-системы для определения фрагмента гена 35S вируса мозаики цветной капусты, используемого в генетически-модифицированных организмах (ГМО), фрагмента геномной ДНК микроорганизма Mycoplasma hominis, а также фрагмента гена глобина человека (белковая часть гемоглобина человека). Разработана экспериментальная установка для лиофилизации, которая позволила оптимизировать условия проведения процесса. Показано, что полученные таким образом алюминиевые микрочипы могут храниться не менее двух месяцев при комнатной температуре, и их аналитические характеристики сравнимы с ПЦР с использованием жидких реактивов, при в 20 раз меньшем потреблении реактивов и в 2-3 раза меньшем количестве операции пипетирования.

         Ключевые слова: Полимеразная цепная реакция, алюминиевые микрочипы, плазменно-химическое осаждение, лиофилизация.

 DOI: http://dx.doi.org/10.15826/analitika.2015.19.4.010


Полный текст:

PDF (Russian)

Литература


Murphy J., Bustin S.A. Reliability of real-time reverse-transcription PCR in clinical diagnostics: Gold standard or substandard? Expert Review of Molecular Diagnostics, 2009, vol. 9, no. 2, pp. 187-197. doi: 10.1586/14737159.9.2.187

Sperling, F.A.H., Anderson, G.S., Hickey, D.A. A DNA-based approach to the identification of insect species used for postmorten interval estimation. Journal of Forensic Sciences, 1994, vol. 39, no. 2, pp. 418-427.

Olsen J.E., Aabo S., Hill W., Notrmans S., Wernars K., Granum P.E. Probes and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens. International Journal of Food Microbiology, 1995, vol. 28, no. 1, pp. 1-78. doi: 10.1016/0168-1605(94)00159-4.

Weiping Y., Liqun D., Jing W., Lingzhi M., Jianbo Z. Simulation and experimental study of PCR chip based on silicon. Sensors and Actuators B, 2005, vol. 108, pp. 695-699. doi: 10.1016/j.snb.2004.11.049

Liu D., Zhou X., Zhong R., Ye N., Chang G., Xiong W. Analysis of multiplex PCR fragments with PMMA microchip. Talanta, 2006, vol. 68, pp. 616-622. doi: 10.1016/j.talanta.2005.04.064.

Morrison T., Hurley J., Garcia J., Yoder K., Katz A., Roberts D., Cho J., Kanigan T., Ilyin S.E., Horowitz D., Dixon J.M., Brenan C. J.H. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Research, 2006, vol. 34, no. 18, pp.1-9. doi: 10.1093/nar/gkl639.

Wang J., Lin M., Crenshaw A., Hutchinson A., Hicks B., Yeager M., Berndt S., Huang W., Hayes R.B., Chanock S.J., Jones R.C., Ramakrishnan R. High-throughput single nucleotide polymorphism genotyping using nanofluidic Dynamic Arrays. BMC Genomics, 2009, vol. 10, pp. 1471-1484. doi: 10.1186/1471-2164-10-561.

Slyadnev М.N. Microchip-based systems for molecular genetics analisys. Russian journal of general chemistry, 2012, vol. 82, no.12, pp. 118-13. doi: 10.1134/S1070363212120353.

Millis K.B., Ferre F., Gibbs R.A. The polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser, 1994. 458 p. doi: 10.1002/hep.1840210344.

Unger M., Manger I.D., Lucero M., Yi Y., Miyashita-Lin E., Weinecke A., Facer G. Microfluidic device and methods of using same. Parent USA, no. 7,118,910 B2, 2006.

Shajhaev G. O. Sukhaia smes’ reagentov dlia polimeraznoi tsepnoi reaktsii i sposob provedeniia ptsr-analiza [Dry mixture of reagents for PCR and the way of PCR-analysis caring out]. Patent RF no. 2 259 401 C1, 2004 (in Russian).

Navolotskii D.V., Perchik A.V., Markyanov I.A., Ganeev A.A., Slyadnev M.N. [Microchip analytical system for multiplex analysis by real time polymerase chain reaction method with immobilized reagents into microreactors]. Prikladnaia biohimiia i microbioilogiia [Applied biochemistry and microbiology], 2011, vol. 47, no. 2, pp. 1-8 (in Russian).

Navolotskii D.V. Krisko A.V., Arnautov V.A., Gejbo D.S., Ganeev A.A., Slyadnev M.N. [Multiplex analytical system for DNA determination by real time PCR method]. Nauchnoe priborostroenie [Scientific instrumentation], 2010, vol. 20, no. 1, pp. 10-20 (in Russian).

Ravi N., Bukhovets V.L., Varshavskaya I.G., Sundararajan G. Deposition of diamond-like carbon films on aluminium substrates by RF-PECVD technique: Influence of process parameters. Diamond & Related Materials, 2007, vol. 16, pp. 90–97. doi: 10.1016/j.diamond.2006.04.001.

Gil E., Park J.B., Oh J.S., Yeom G.Y. Characteristics of SiOx thin films deposited by atmospheric pressure chemical vapor deposition as a function of HMDS/O2 flow rate. Thin Solid Films, 2010, vol. 518, pp. 6403-6407. doi: 10.1007/s11666-011-9642-0.

Zanini S., Riccardi C., Orlandi M., Grimoldi E. Characterisation of SiOxCyHz thin films deposited by low-temperature PECVD. Vacuum, 2008, vol. 82, pp. 290-293. doi: 10.1016/j.vacuum.2007.07.001.

Rey L., May J.C. Freese-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products. New York: Taylor and Frencis, 2004. 600 p. doi: 10.1201/9780203021323.

Suvorova O., Perchik A., Slyadnev M., Navolotskii D., Mushnikov N. Rapid determination of sexually transmitted infections by real-time polymerase chain reaction using microchip analyzer. Engineering, 2012, vol. 4, pp. 1-3. doi: 10.4236/eng.2012.410B001.


Ссылки

  • На текущий момент ссылки отсутствуют.