УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО МИКРОБНОГО ЧИСЛА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ РЕАКЦИЙ В ОРГАНИЗОВАННЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМАХ
Аннотация
Хемилюминесцентный метод определения микроорганизмов, основанный на определении аденозинтрифосфата (АТФ), который содержится в клетках бактерий, в целом состоит из трех стадий: пробоподготовки, устраняющей мешающее влияние матрицы образца, аналитической реакции и обработки полученного сигнала. Данная работа направлена на совершенствование второго этапа анализа – оптимизацию условий проведения хемилюминесцентной реакции. АТФ инициирует хемилюминесценцию люминола, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации АТФ. Нами были оптимизированы условия проведения данной хемилюминесцентной реакции для определения общего микробного числа (ОМЧ) в водных средах. Для этого проведено сравнение двух хемилюминесцентных реагентов: люминола и его гидрофобного аналога N-октиллюминола, который способен образовывать мицеллы. Переход к хемилюминесцентной системе на основе N-октиллюминола позволил увеличить чувствительность метода в 5.5 раз за счет микроконцентрирования аналита в ядре собственных мицелл. Нами было определено и обсуждено влияние неионогенных поверхностно-активных веществ на хемилюминесцентный способ определения бактерий. При этом выявлено, что добавление неионогенных поверхностно-активных веществ ухудшает аналитический сигнал за счет уменьшения локальной концентрации АТФ в мицеллах. Для аналитических систем, основанных на окислении люминола и N-октиллюминола, определены показатели точности, правильности, повторяемости и внутрилабораторной прецизионности. Применение разработанной хемилюминесцентной системы позволило существенно улучшить методику определения ОМЧ с переходом от качественного определения микроорганизмов к количественному измерению в диапазоне от 4×105 до 1×107 КОЕ/мл. При этом погрешность определения была снижена с 80 до 26 %.
Ключевые слова: хемилюминесценция, мицеллярные системы, люминол, аналог люминола, общее микробное число, поверхностно-активные вещества
DOI: http://dx.doi.org/10.15826/analitika.2020.24.1.001Полный текст:
PDF (Russian)Литература
REFERENCES
Gosudarstvennaia farmakopeia Rossiiskoi Federatsii, XII izdanie, tom 2 [State Pharmacopoeia of the Russian Federation, XIII Edition, Volume 2], Moscow, 2015 (in Russian).
Bonadonna L., Briancesco R., La Rosa G. Innovative analytical methods for monitoring microbiological and virological water quality. Microchemical Journal., 2019, vol. 150, pp. 104-160. doi: 10.1016/j.microc.2019.104160
Bushon R.N., Likirdopulos Ch.A., Brady A.M.G. Comparison of immunomagnetic separation/adenosine triphosphate rapid method to traditional culture-based method for E. coli and enterococci enumeration in wastewater. Water Research., 2009, vol. 43, pp. 4940–4946. doi: 10.1016/j.watres.2009.06.047
Hammes F., Egli T. Cytometric methods for measuring bacteria in water: advantages, pitfalls and applications. Anal Bioanal Chem., 2010, vol. 397, pp. 1083–1095. doi: 10.1007/s00216-010-3646-3
Kennedy D., Wilkinson M.G. Application of Flow Cytometry to the Detection of Pathogenic Bacteria. Curr. Issues Mol. Biol., 2017, vol. 23, pp. 21-38. doi: 10.21775/cimb.023.021.
Yue H., He Y., Fan E., Wang L., Lu S., Fu Z. Label-free electrochemiluminescent biosensor for rapid and sensitive detection of pseudomonas aeruginosa using phage as highly specific recognition agent. Biosens. Bioelectron., 2017, vol. 94, pp. 429-432. doi: 10.1016/j.bios.2017.03.033
Chen S., Cheng F. Biosensors for bacterial detection. Int. J. Biosen. Bioelectron, 2017, vol. 2, pp. 197-199. doi: 10.15406/ijbsbe.2017.02.00048
Kumar N., Hu Y., Singh S., Mizaikoff B. Emerging Biosensor Platforms for the Assessment of Water-Borne Pathogens. Analyst, 2018, vol. 143, pp. 359-373. doi: 10.1039/C7AN00983F
Santos I., Hildenbrand Z., Schug K. Applications of MALDI-TOF MS in environmental microbiology. Analyst, 2016, vol. 141, pp. 2827-2837. doi: 10.1039/C6AN00131A
Singhal N., Kumar M., Kanaujia P.K., Virdi J.S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Front Microbiol, 2015, vol. 6, pp. 791-791. doi:10.3389/fmicb.2015.00791
Alvarez A., Hernandez E., Toranzos G. Advantages and Disadvantages of Traditional and Molecular Techniques Applied to the Detection of Pathogens in Waters. Water Sci, 1993, vol. 27, pp. 253-256. doi: 10.2166/wst.1993.0354
Miller J.N., Nawawi M.B., Burgess C. Detection of bacterial ATP by reversed flow-injection analysis with luminescence detection. Anal. Chim. Acta, 1992, vol. 266, pp. 339-343. doi: 10.1016/0003-2670(92)85061-A
Capriţa R., Capriţa A., Vintila T., Ilia G. The ATP assay, a method for measuring biological activity in industrial water, Revue Roumaine de Chimie, 2006, vol. 51, I. 10, pp. 1031-1036.
Khlyntseva S.V., Bazel Ya.R., Vishnikin A.B., Andruch V. Methods for the determination of adenosine triphosphate and other adenine nucleotides. J. Anal. Chem, 2009, vol. 64, pp. 657-673. doi: 10.1134/S1061934809070028
Satoh T., Kato J., Takiguchi N., Ohtake H., Kuroda A. ATP Amplification for Ultrasensitive Bioluminescence Assay: Detection of a Single Bacterial Cell. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2004, vol. 68, I. 6, pp. 1216-1220. doi: 10.1271/bbb.68.1216
Kamidate T., Yanashita K., Tani H., Ishida A., Notani M. Firefly Bioluminescent Assay of ATP in the Presence of ATP Extractant by Using Liposomes. Anal. Chem., 2006, vol. 78, pp. 337-342. doi: 10.1021/ac058038n
Ishutin V.A., Stekhin A.A., Iakovleva G.V., Koriakin Iu.N., Zubarev A.F., Doskina T.V., Rakhmanin Iu.A., Nedachin A.E., Mikhailova R.I., Streliaeva N.E., Krivolapova N.S., Podunova L.G., Skachkov V.B. Metody kontrolia. Biologicheskie I mikrobiologicheskie faktory ekspress-metod opredeleniia mikrobiologicheskikh pokazatelei kachestva pit’evoi vody, vody poverkhnostnykh i podzemnykh istochnikov [Control methods. Biological and microbiological factors rapid method for determining microbiological indicators of the quality of drinking water, surface and underground water sources]. Guidelines RF, 1999 (in Russian).
Axenov A.V., Ishutin V.A., Karmishin A.Iu. Ekspressnyi sposob opredeleniia mikroskopicheskikh gribov, bakterii i drozhzhei [Express method for the determination of microscopic fungi, bacteria and yeast]. Patent RF, no. 2276190, 2006. (in Russian)
Trofimov S.I., Miheeva I.V. [Improving the chemiluminescent express method for assessing the level of bacterial contamination of the aquatic environment]. Naychnye i obrazovatelnye problemi grazhdanskoi zashchity [Scientific and educational problems of civil protection], 2011, vol. 4, pp. 57-62. (in Russian)
Yankova T.V. [Organized molecular systems in the chemiluminescent reaction of luminol]. Materialy Mezhdynarodnogo molodezhnogo nauchnogo foruma “Lomonosov-2018” [Materials of the International Youth Scientific Forum "LOMONOSOV-2018"]. Moscow, 2018, pp. 904-904. (in Russian)
Yankova T.V., Melnikov P.V., Zaytsev N.K. Chemiluminescent reactions of luminol and N-octiluminol with hypochlorite in anionic surfactants. Moscow University Chemistry Bulletin, 2019, vol. 74, no. 3, pp. 116-121. doi: 10.3103/S002713141903012X
Yankova T.V., Melnikov P.V., Yashtulov N.A., Zaytsev N.K. Khemiliuminestsentnye reaktsii liuminola i N-oktilliuminola s gipokhloritom v rastvorakh neionogennykh poverkhnostno-aktivnykh veschestv [Chemiluminescent reactions of luminol and N-octiluminol with hypochlorite in nonionic surfactants]. Fine Chemical Technologies, 2019, vol. 14, no. 3, pp. 90. (in Russian) doi: 10.32362/2410-6593-2019-14-3-90-97
Gerdes S.Y., Scholle M.D., Campbell J.W., Balazsi G., Ravasz E., Daugherty M.D., Somera A.L., Kyrpides N.C., Anderson I., Gelfand M.S., Bhattacharya A., Kapatral V., Souza M.D., Baev M.V., Grechkin Y., Mseeh F., Fonstein M.Y., Overbeek R., Barabasi A.L., Oltvai Z.N., Osterman A.L. Experimental Determination and System Level Analysis of Essential Genes in Escherichia coli MG1655. Journal of Bacteriology, 2003, vol. 185, pp. 5673–5684. doi: 10.1128/JB.185.19.5673-5684.2003
RMG 61-2010 GSI. Gosudarstvennaya sistema obespecheniia edinstva izmerenii. Pokazateli tochnosti, pravilnosti, pretsizionnosti metodik kolichestvennogo khimicheskogo analiza. Metodi ozenki [RMG 61-2010 GSI State system for ensuring the uniformity of measurements. Indicators of accuracy, correctness, precision of methods of quantitative chemical analysis. Evaluation Methods]. Moscow, Standartinform Publ., 2012. 62 p. (in Russian).
DOI: https://doi.org/10.15826/analitika.%202020.24.1.001
Ссылки
- На текущий момент ссылки отсутствуют.